Essa semana preparei um texto sobre os principais interferentes que encontramos no dia a dia ao sequenciarmos amostras emblocadas em parafina.
A fixação em formol é uma das causas, mas existem outras.
Há inúmeras vantagens em emblocar o tumor para estudo molecular, já que possue baixo custo de armazenamento e possibilita testagens quantas vezes forem necessárias, até o esgotamento do bloco, mesmo após anos da coleta. Apesar disso, é importante saber de suas limitações.
Veja aqui os 4 principais fatores que prejudicam seu sequenciamento tumoral.
Boa leitura!
NGS para amostras em parafina:
4 fatores pré-analíticos que interferem na sua performance.
As amostras conservadas em parafina são uma grande fonte de informação na jornada diagnóstica do paciente oncológico. Com esse processo de conservação, uma biópsia ou peça cirúrgica pode fornecer dados sobre o tumor mesmo após anos da coleta. Trata-se de uma técnica antiga, hoje mais automatizada, que mesmo com o surgimento de outras opções, como o congelamento a -80C, não foi substituída nos principais centros diagnósticos. Apesar disso, a fixação em formol gera artefatos que impactarão na análise molecular.
Todo o processo se inicia ao colocarmos uma amostra em formol tamponado a 10%, logo após sua exérese, para evitar a autólise celular. Ao chegar ao laboratório, a amostra passa por banhos sequenciais de formol, etanol e xilol e depois é mergulhada em parafina líquida, para formar um bloco sólido contendo o tecido fixado.
Além dos inerentes ao processo de conservação, sequenciar um tecido apresenta outros desafios, que não existem quando sequenciamos sangue ou saliva, por exemplo.
Veja aqui os 4 principais fatores que prejudicam o sequenciamento de uma amostra tumoral de um tecido humano:
Deaminação induzida por formol: a fixação em formol causa deaminação da base citosina (C), que é substituída por uma uracila (U). Em consequência dessa “falsa base” U, uma base A será incorporada à fita complementar durante o preparo da biblioteca. Dessa forma é gerada uma troca artefatual C.G > T.A que será amplificada de forma logarítmica na PCR. SNVs artefatuais resultantes de fixação em formol correspondem a 1% do número total das chamadas quando a cobertura está baixa.
Tempo e qualidade da fixação: estudos mostram que fixar a amostra por 48h ou mais é prejudicial para o estudo molecular pois aumenta a fragmentação do DNA, e a taxa de deaminação de C. A má qualidade do formol tamponado e da parafina também podem prejudicar a qualidade do sequenciamento, levando ao aparecimento de regiões de baixa cobertura e variantes falsas.
Tamanho da amostra: as dimensões cada vez menores das biópsias são um desafio para o diagnóstico molecular por apresentarem baixa celularidade. Muitas vezes a biópsia é tão pequena que não atingimos o input mínimo de DNA para a construção da biblioteca. A celularidade é a densidade de células em uma área demarcada e está intimamente relacionada à frequência alélica de uma variante (VAF).
Terapia neoadjuvante: peças que foram sequenciadas após quimioterapia neoadjuvante podem apresentar grandes áreas de necrose, deixando pouco tecido tumoral viável para a extração. Um tumor pós quimioterapia apresenta baixa celularidade, com células tumorais esparsas, em meio a desmoplasia estromal e calcificações.
Por decorrência de todos esses desafios, é essencial a avaliação do tecido por um patologista, previamente à extração, para um bom resultado de sequenciamento.
No próximo artigo, falarei mais detalhadamente sobre celularidade, como eleger a melhor área para extração e como driblar os interferentes.
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Até breve!
Dra. Ana Carolina Paniza
Patologista Molecular
CRM-SP 151630