Abstract

Somatic mutations in cancer driver genes can help diagnosis, prognosis and treatment decisions. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) specimen is the main source of DNA for somatic mutation detection. To overcome constraints of DNA isolated from FFPE, we compared pyrosequencing and ddPCR analysis for absolute quantification of BRAF V600E mutation in the DNA extracted from FFPE specimens and compared the results to the qualitative detection information obtained by Sanger Sequencing. Sanger sequencing was able to detect BRAF V600E mutation only when it was present in more than 15% total alleles. Although the sensitivity of ddPCR is higher than that observed for Sanger, it was less consistent than pyrosequencing, likely due to droplet classification bias of FFPE-derived DNA. To address the droplet allocation bias in ddPCR analysis, we have compared different algorithms for automated droplet classification and next correlated these findings with those obtained from pyrosequencing. By examining the addition of non-classifiable droplets (rain) in ddPCR, it was possible to obtain better qualitative classification of droplets and better quantitative classification compared to no rain droplets, when considering pyrosequencing results. Notable, only the Machine learning k-NN algorithm was able to automatically classify the samples, surpassing manual classification based on no-template controls, which shows promise in clinical practice.

Tradução

As mutações somáticas nos genes causadores de câncer podem ajudar no diagnóstico, prognóstico e decisões de tratamento. Amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) são a principal fonte de DNA para a deteção de mutações somáticas. Para superar as limitações do DNA isolado de FFPE, comparamos a pirosequenciação e a análise ddPCR para quantificação absoluta da mutação BRAF V600E no DNA extraído de amostras FFPE e comparamos os resultados com as informações de detecção qualitativa obtidas pela sequenciação Sanger. A sequenciação Sanger foi capaz de detectar a mutação BRAF V600E apenas quando esta estava presente em mais de 15% do total de alelos. Embora a sensibilidade da ddPCR seja superior à observada para o Sanger, foi menos consistente do que a pirosequenciação, provavelmente devido ao viés de classificação de gotículas do ADN derivado de FFPE. Para resolver o viés de alocação de gotículas na análise ddPCR, comparamos diferentes algoritmos para classificação automatizada de gotículas e, em seguida, correlacionamos esses resultados com os obtidos pela pirosequenciação. Ao examinar a adição de gotículas não classificáveis (chuva) na ddPCR, foi possível obter uma melhor classificação qualitativa das gotículas e uma melhor classificação quantitativa em comparação com a ausência de gotículas de chuva, quando se consideram os resultados da pirosequenciação. É de salientar que apenas o algoritmo de aprendizagem automática k-NN foi capaz de classificar automaticamente as amostras, superando a classificação manual baseada em controles sem molde, o que se revela promissor na prática clínica.