No primeiro artigo dessa série falaremos um pouco sobre o Sequenciamento de nova geração, mais conhecido na prática clínica como NGS, que é a sigla para o seu nome em ingles – Next Generation Sequencing. A primeira vez que ouvi falar sobre essa técnica foi durante meu mestrado e de lá pra cá ela já se tornou cotidiana para nós que trabalhamos com testes laboratoriais.
- Metodologia também encontrada pelos nomes:
- Sequenciamento Massivo em Paralelo (Massive Parallel Sequencing)
- Sequenciamento de Alta Performance (High-throughput Sequencing)
Para entendermos de forma mais simples, vou dividir a técnica em 4 etapas:
- A construção da biblioteca
- A amplificação dos fragmentos
- O sequenciamento propriamente dito
- A análise dos dados gerados
A construção da biblioteca: construir a biblioteca significa gerar os fragmentos de DNA. Esses fragmentos devem ter um tamanho adequado, que para essa técnica está em torno de 200 pares de bases. Podemos gerar os fragmentos através de reação de PCR multiplex, digestão enzimática ou fragmentação mecanica. Depois disso, os fragmentos receberão adaptadores de extremidade e também um barcode, que permitirá identificar especificamente cada amostra. É graças a essa adição dos barcodes que podemos sequenciar até 300 amostras ao mesmo tempo, todas juntas, sem perder a rastreabilidade! Isso não é sensacional?
Já os adaptadores de extremidades são sequências de DNA conhecidas, que serão uteis durante a amplificação.
A amplificação dos fragmentos: essa fase nada mais é do que uma grande reação de PCR. Os adaptadores de extremidades se anelam com primers fornecidos pela reação e a cada nucleotídeo incorporado pela DNA polimerase, há liberação de um sinal que será identificado pelo equipamento.
Na plataforma da Illumina, a amplificação ocorre por PCR em ponte, com formação de clusters para gerar um sinal fluorescente a cada incorporação de nucleotídeo. Já na plataforma da Thermo Fisher, a amplificação ocorre por PCR em emulsão, dentro de micelas, com a liberação de íon de hidrogênio a cada incorporação. Existem outras plataformas mas essas duas são as mais utilizadas atualmente.
O sequenciamento propriamente dito: nessa etapa o equipamento identifica as bases que vão sendo incorporadas e gera bilhões de fragmentos de DNA (reads) ao mesmo tempo, para serem posteriormente analisados.
A análise dos dados gerados: as sequências geradas serão alinhadas com uma sequência de referência para buscar possíveis alterações no DNA (mutações por exemplo). Toda a análise de NGS é feita através de pipelines de bioinformática, que falaremos mais detalhadamente na aula 4 dessa série.
Esse pequeno vídeo da Illumina, a plataforma de sequenciamento mais utilizada no mundo, traz de forma simples e resumida como ocorre um sequenciamento por síntese.
Overview of Illumina Sequencing by Synthesis Workflow | Standard SBS chemistry
Indicações e limitações:
Nosso genoma é composto por cerca de 20 mil genes. Com o NGS, é possível sequenciar o genoma inteiro ou apenas áreas específicas dele, de forma rápida, eficiente e a um custo acessível. Existem algumas peculiaridades importantes que o médico precisa saber ao solicitar um teste de sequenciamento:
- Sequenciamento do genoma completo: é o sequenciamento de todo material genético de um paciente, o que inclui o DNA codificante (2% do genoma) e o não codificante (regiões intrônicas). É mais utilizado em pesquisas, para doenças pouco conhecidas, pouco indicado para prática clínica.
- Exoma: indicado para o diagnóstico clínico nos casos com mais de uma hipótese diagnóstica ou que ainda não se tem hipótese diagnóstica específica. É muito utilizado para o diagnóstico de autismo e atraso do desenvolvimento neuropsicomotor em crianças. O resultado é um arquivo com as mutações encontradas em todos os genes do paciente, o que exige um maior tempo de análise.
- Painel de genes: indicado nos casos em que há hipótese diagnóstica de uma doença específica. Existem hoje dezenas de painéis disponíveis, com poucos genes e até com mais de 100 genes. É possível utilizar sangue, saliva ou bloco de parafina para a testagem. Há painel para epilepsias, doenças cardiovasculares, hematológicas, cancer hereditário, entre outros.
Limitações do teste: o método de NGS sequencia fragmentos curtos de DNA (short reads), que costumam variar de 50 a 300 nucleotídeos de comprimento. Pequenas inserções e deleções, menores que 50 pares de bases, estão fora do seu limite de detecção. Alterações em regiões repetitivas (G:C ou A:T), ou em regiões de grande homologia, como pseudogenes, podem impossibilitar a confirmação da localização exata da mutação. Alterações restritas a um único exon ou presentes em regiões promotoras e intergênicas também podem não ser detectadas pela metodologia.
O NGS não detecta alterações estruturais como translocações e inversões; Para essa suspeita é indicado iniciar a investigação pelo cariótipo. Para busca de grandes deleções ou duplicações, o NGS não é indicado; O MLPA seria a técnica mais adequada para estudar tais alterações.
Nos próximos artigos discutiremos especificamente sobre a aplicação dessa técnica para o diagnóstico de cancer somático e vou compartilhar um pouco de minha prática diária na análise de tumores.
Até breve.
Dra. Ana Carolina Paniza
Patologista Molecular
CRM-SP 151630